동물 세포 배양 이론

동물 세포 배양 이론

 

 배양세포는 실험 동물의 한기관에서 얻은 세포의 성장으로부터 유래된 것이다. 세포배양은 조직 의 일부분을 무균적으로 떼어내 효소로 세포간 연결 물질을 분해하여 유리시킨 현탁액을 병이 나 페트리 접시와 같은 편편한 밑부분에 도말한다. 일반적으로 세포는 유리표면에 부착할 수 있 는 당단백질성 물질을 생산한다. 이때 글라스나 페트리접시에 부착한 세포의 엷은층 즉 단층 (monolayer)에 적당량의 배양액을 덛붓는다. 세포배양에 사용되는 배양기 조성은 꽤 복잡하다. 즉 많은 수의 아미노산과 비타민, 염류, 포도당 그리고 중탄산염완충용액이다. 최적세포생장을 얻기 위해서는 소량의 혈청이 필요하며, 세균 감염을 방지하기 위해서 몇 종의 항생제를 첨가한다.

     이같이 마련된 무한 생장능이 있는 세포배양기는 영속세포계로 안정화시킬 수 있다. 이런 세포계는 계속적으로 세포를 이용할 수 있기 때문에 바이러스 연구에 아주 편리하다. 영속 세포계를 얻을 수 없는 경우에는 수일 동안 살아남을 수 있는 일차 세포배양(primary cell culture)이 이용된다. 물론 이런 방법은 배양을 수시로 새로이 마련해야 한다.

     또 다른 경우는 전체 또는 일부 기관을 배양하는 방법이다. 제어된 실험실 조건하에서 바이러스 생장이 가능하기 때문에 기관 배양(organ culture)방법도 이용될 수 있다.

   1. cell line(세포계)

     동물세포를 오랜 기간 배양하려는 시도는 항상 실패해 왔다. 신선한 배지를 계속 갈아주어도 증 식은 50세대 이상 계속되지 못했다. 그러나 경우에 따라 세포는 돌연변이에 의해 무한정 성장할 수 있는 능력을 지니기도 하는데, 그러한 불멸세포의 자손들을 세포계(cell line)라 한다. 일부 세포계는 배양시 암세포처럼 행동하지만, 다른 것들은 접촉억제를 나타낸다. 배양된 세포가 접촉억제를 잃어버리면 형질전환(transformation) 되었다고 한다. 형질전환실험은 종양비루스와 함 께 발암물질을 검사하는 유용한 수단으로서, 세포를 화학물질이나 비리온의 현탁액과 함께 혼합 하여 배양하고 형질전환된 세포집단의 수를 측정하는 것이다.

     바이러스가 실험실에서 정상적으로 자랄때에 continuous cell line이 사용되어진다. 이러한 것들 은 무한한 수의 세대를 거쳐서 지속되어 지는 변형된 세포들이며 이러한 것들은 때때로 immor -tal cell line 라고 한다. 이중 하나인 Hela cell line은 어떤 여자의 암세포에서 분리되었다. 몇 년에 걸친 실험실 배양후엔 이러한 많은 cell line들이 세포의 거의 모든 원래의 특성을 잃어버렸다. 그러나 이러한 변화들은 바이러스 증식에 대한 세포의 사용을 방해하진 않았다. 바이러스 분리와 성장에 대한 세포배양의 성공에도 불구하고 세포배양에서 성공적으로 배양되지 않는 몇몇 바이러스 들이 여전히 존재한다.

   2. 미생물영양의 원리

    생물체는 증식하기 위해 세포구성물질의 합성과 에너지의 생성에 요구되는 여러 가지 물질들을 환경으로부터 얻어야 한다. 이러한 물질들을 영양소(nutrient)라 한다. 따라서 배지에는 모든 필요한 영양소들이 적절한 양으로 들어 있어야 한다. 그러나 미생물들은 생리적 특성이 상당히 다 양하므로 그들의 영양요구성 또한 다양하다. 실제로 미생물들을 위해 수천의 다른 배지들이 고안되었고, 이들 배지를 설명하는 데 있어서 때로는 여러 가지 성분이 들어 있어야 하는 이유를 분명히 밝히지 못하고 있다. 그럼에도 불구하고 배지의 고안은 과학적 원리, 즉 우리가 배지의 설명에 앞서 미리 언급하게 되는 영양의 원리(principle of nutrition)에 근거를 두어야만 한다.

     세포의 화학적 조성은 생명체를 통틀어 거의 일정한데 이것은 생장을 위해 필요한 주요물질을 암시해준다. 물은 세포의 전체 중량의 약 80 ~ 90%를 차지하므로 양적인 면에서 볼 때 가장 중요한 영양분이다. 세포의 고체물질은 수소와 산소 (물질대사로 물에서 유래한)외에 탄소, 질소, 인, 황의 순으로 함유되어 있다. 이들 6가지 원소들은 세포건조중량의 약 95%를 차지하고 있다. 다른 많은원소들이 나머지 부분을 차지하고 있다. 영양학적 연구에 따르면 칼륨, 마그네슘, 칼 슘, 철, 망간, 코발트, 구리, 몰리브덴, 아연 등은 대부분의 생물체에서 필요로 한다. 필요로 하는 모든 금속원소는 무기염류의 양이온 형태의 영양분으로서 제공될 수 있다. 칼륨, 마그네슘, 칼슘 그리고 철은 비교적 많은 양을 필요로 하므로 항상 배지에 염으로 넣어주어야 한다.
     망간, 코발 트, 구리, 니켈, 몰리브덴, 그리고아연 등의 양적 요구량은 매우 적다. 실제로 그 요구량이 너무 적어 그들의 중요성을 설명하는데 어려움이 있다. 왜냐하면 이들은 배지에 주요한 무기구성분의 오염물로서 충분한 양이 존재하기 때문이다. 이들은 때때로 미량원소(trace element) 또는 미영 양소(micronutrient)로 불린다. 비금속원소 중의 하나인 인은 무기물형태의 인산염으로서 제공하면 영양분으로 사용할 수 있다.

     몇몇 생물군들은 그 이외에 특이한 무기물을 요구한다. 예를들면 규조류나 일부 다른 조류는 실리카가 매우 많이 포함되어 있는 세포벽을 만든다. 따라서 이들은 특별히 규산염형태로 실리 콘을 필요로 한다. 비록 대부분의 미생물에서는 나트륨 요구성을 설명할 수 없다고 하더라도 특정 해양세균이나 시아노 박테리아 그리고 광합성세균들은 비교적 높은 농도로 나트륨을 필요로 한다. 이러한 군에서 나트륨은 다른 1가의 양이온으로 대치될 수 없다.

     탄소, 질소, 황 그리고 산소에 대한 요구성은 생물에 따라 영양분으로서 제공되는 이원소들의 특정한 화학적 형태가 각기 다르므로 간단히 설명될 수 없다.

   3. 탄소의 요구

     광합성을 하는 생물과 무기물을 산화하여 에너지를 얻는 세균들은 세포의 유일한 또는 주요한 탄소원으로서 가장 산화된 형태의 탄소, 즉 CO2를 이용한다. CO2가 유기세포 구성물질로 전환 되는 과정은 총체적인 에너지의 공급이 요구되는 환원과정이다 따라서 이러한 생리적 군에서 빛이나 환원형 무기화합물의 산화로부터 생긴 에너지의 상당부분은 CO2를 유기물의 수준으로 까지 환원시키는 데 사용된다.

     다른 모든 생물체들은 대부분 유기영양분으로부터 탄소를 얻는다. 대부분의 유기물질들은 세포 구성물질과 동일한 산화수준에 있기 때문에 이들은 세포의 탄소원으로서 작용하기 위해 일반적 으로 일차적인 환원을 하지는 않는다. 더욱이 세포가 생합성을 하는 데에 필요로 하는 탄소를 충족시키기 위해 유기기질은 종종 세포의 에너지필요량을 공급해 주어야만 한다. 결과적으로 유기기질내에 있는 상당량의 탄소는 에너지를 생성하는 물질대사경로로 투입되어 결국 CO2(에너지를 생성하는 호홉대사의 주요산물) 또는 CO2와 유기화합물(발효대사의 대표적인 최종산물)로서 세포에서 방출된다. 따라서 유기기질은 이중의 영양역할을 하게 된다. 즉, 그들은 탄소원으로서, 그리고 동시에 에너지원으로서 작용한다. 많은 미생물들은 단일 유기화합물을 사용하여 이 들 2가지의 영양요구를 완전히 충족시킬 수 있다. 그러나 다른 미생물들은 1가지 유기화합물만을 공급하여 주었을 때는 생장하지 못하며, 이들은 영양분으로서 다수의 부가적인 유기화합물들 을 필요로 한다. 이러한 부가적인 유기영양분들은 완전히 생합성기능만을 갖고 있으며 생물체가 합성할 수 없는 어떤 유기세포구성물질의 전구물질로 요구된다. 이들은 생장소(groth factor)라 하는데, 그들의 역할은 나중에 자세히 기술될 것이다.

     미생물들이 탄소와 에너지의 주요공급원으로서 사용할 수 있는 유기화합물의 종류는 상당히 다 양하다. 이러한 다양성은 미생물에 의해 탄소원과 에너지원으로서 사용될 수 없는 천연유기화합 물은 하나도 없다는 사실로 입증된다. 따라서 미생물을 위한 유기 탄소원의 화학적 특성을 명료 하게 나타내는 것은 불가능하다. 이런 현저한 탄소요구의 다양성은 미생물학의 매혹적인 생리적 측면의 하나이다.

     개개의 미생물의 유기탄소요구성을 조사해 보면 어떤 것은 고도의 유용성을 나타내는 반면 어떤 것은 극히 한정되어 있다. 예를 들어 Pseudomonas군의 일부 세균은 그들의 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 90가지 이상의 상이한 유기화합물을 사용할 수 있다.

     다른 극단적인 예로서 몇몇 메탄산화균은 메탄과 메탄올 두 종류의 유기질만을 사용할 수 있으 며, 셀룰로오스를 분해하는 일부 세균은 셀룰로오스만을 이용할 수 있다.

     유기탄소원을 필요로 하는 대부분의 생물체들은 또한 영양분으로서 소량의 CO2를 필요로 한다. 왜냐하면 이 화합물은 몇가지 생합성반응에서 이용되기 때문이다. 그러나 유기화합물을 사용하 는 생물체에 의해 정상적으로 대량의 CO2가 생기므로, 생합성적 요구는 유기탄소와 에너지원의 물질대사를 통해 충족될 수 있다. 그럼에도 불구하고 CO2를 완전히 제거하려면 유기배지에 있 는 미생물의 생장이 저해되거나 지연된다. 그리고 어떤 세균과 균류는 유기 배지에서 만족할만한 생장을 하기 위해서 비교적 높은 농도의 대기중의 CO2(5 ~ 10%)를 필요로 한다.

   4. pH의 조절

     주어진 배지가 생장의 개시에 적당할지라도 그 후의 미생물개채군의 생장은 그 생물체 자체의 생장과 물질대사로 인해 초래되는 배지의 화학적 변화에 의해 심각하게 제한될 수도 있다. 예를 들면 포도당이 들어있는 배지에서 발효의 결과로 생산되는 유기산은 생장을 저해할 수 있다.

     반면에 미생물에 의한 배지의 음이온 성분의 분해나 이용은 배지를 더욱더 염기성으로 만든다. 예컨대 숙신산 나트륨 한 분자의 산화로 인하여 강한 염기성염인 탄산나트륨의 형태로 2개의 나트륨이온이 방출된다. 단백질과 아미노산의 분해 역시 암모니아를 생성하므로 배지를 염기성으 로 만든다. 수소이온농도의 급격한 변화를 막기위해 완충제나 불용성 탄산염을 종종 배지에 첨 가해 준다.

     일수소 인산염과 이수소이산염의 혼합물로 구성된 인산염완충액은 대단히 유용하다. KH2PO4는 약산 염인 반면 K2HPO4  이는 약염기의 염이므로 이 둘의 동일 몰농도 용액은 pH 6.8 정도로 거의 중성이다. 제한된 양의 강산을 이러한 용액에 첨가하면 염기성 염의 일부분은 약산염으로 전환된다.

K2HPO4 + HCl ->   KH2PO4 + KCl

K2HPO4 + KOH  ->   KH2PO4 + H2O

     따라서 이러한 용액은 배지에서 산이나 염기가 생길 때 급격한 수소이온농도의 변화를 막아 주는 완충제로서 작용한다. 산성 인산염과 염기성 인산염을 서로 다른 비율로 사용함으로써 약 pH 6.0 ~ 7.6범위의 서로 다른 pH값의 완충액을 만들 수 있다. 그러나 완충액의 능력은 산, 염 기구성성분의 양에 의해 제한되기 때문에 훌륭한 완충작용은 pH 6.4 ~ 7.2 범위의 좀더 좁은 범위에서만 얻어질 수 있다. 따라서 초기의 완충액이 산성일수록, 수소이온농도의 증가(pH의 감소)를 막는 능력은 증가한다. 반대로 초기의 완충액이 염기성일수록, pH의 증가를 막는 능력은 감소되며 산성화를 막는 능력을 증가한다.

     인산염은 비교적 미생물에게 유독하지 않고 중성 근처의 생리적으로 중요한 범위에서 완충작용을 하는 유일한 무기물이기 때문에 배지르 준비하는데 많이 사용된다. 더욱이 이들은 미생물의 생장에 필수적 원소인 인의 공급원이다. 인산염은 높은 온도에서 생장을 저해하므로 배지에 사 용될 수 있는 인산염완충제의 양은 배양될 특정생물체의 내성에 의해 제한된다. 일반적으로 배지 1L당 5g의 인산칼륨은 세균이나 균류에 의해 내성을 갖는다.

     배양후 배지에 상당량의 산이 생성된다면 제한된 양의 완충제만으로는 적당한 pH를 유지시키기에 불충분하다. 이러한 경우에는 배지에 저장알칼리로서 탄산염을 첨가시켜 생성되는 산을 중화 시킬 수 있다. 수소이온의 존재하에서 탄산염은 중탄산염으로 전환되며 중탄산염은 탄산으로 전 환되는데 이는 자발적으로 CO2와 물로 분해된다.이러한 반응계열은 모두 가역적이며 아래와 같이 요약할 수 있다.

CO32ⓒ   ---  HCO3-   ---  H2CO3    ---  CO2 + H2O

     H2CO3는 매우 약산이고 대기중으로 CO2를 상실하면서 분해되기 때문에 탄산염을 첨가하면 수소이온의 축적을 방지할 수 있고 따라서 배지에서 산을 없앨 수 있다. Na2CO3와 같은 가용성 탄산염은 강염기성이므로 배지에 사용하기에는 적당치 않다. 반면 불용성 탄산염은 많은 배지에 서 매우 유용한 성분이다. 이들 불용성 탄산염 중에는 분필(CaCO3)이 가장 일반적으로 사용된다. 특히, 그의 불용성 때문에 다른 완충제와 함께 쓰일 경우 탄산칼슘은 배지에 강염기성 상태를 초래하지 않는다. 그러나 용액의 pH가 약 7.0이하로 떨어지면 탄산염은 CO2를 방출하면서 분해된다. 따라서 이것은 배지에서 생성하는 어떤 산에 대해서도 산을 칼슘염으로 전환시키는 중화제 역할을 한다.

     산을 생성하는 세균을 분리하고 배양하는데 있어서 탄산칼슘을 한천배지에 첨가하면 중성조건을 유지하도록 해준다. 뿐만 아니라 산을 형성하는 콜로니들은 침전된 탄산칼슘을 분해하여 주위에 투명대를 형성하기 때문에 배지의 불투명한 바탕에서 쉽게 인지될 수 있다.

     어떤 경우에는 완충제나 불용성 탄산염 모두 배지에서 pH를 일정하게 유지시키는데 사용할 수 없다. 예를 들어 탄산칼슘의 존재가 바람직하지 못할 때, 매우 많은 양의 산이 배지에서 생기면 특수한 문제가 제기된다. 더욱이 세균이 성장함에 따라 염기성 물질이 생성되는 약염기성 배지 의 pH를 조절하는 데에는 더욱 심각한 어려움이 있게 된다. 이것은 인산염완충액이 pH 7.2 ~ 8.5 범위에서 효과적이지 못하기 때문이다. 이 범위에서 적당하게 쓰일 수 있는 완충제는 소수 이다. 그러므로 어떤 경우에는 주기적으로나 연속적으로 강산이나 강염기를 무균적으로 첨가해 줌으로써 배지의 pH를 조절하는 것이 필요하다. 몇몇 실험실과 산업공장에서는 이러한 목적을 달성하기 위해 정교한 기계를 사용한다. 이 기계로 인해 배지를 계속 적정하는 것이 용이해졌으며, pH는 거의 일정하게 유지된다. 많은 미생물들은 중성이나 약산성상태를 좋아하므로 적당한 완충제를 사용하여 조절할 수 있다.

   5. 이산화탄소의 공급

     광독립영양체와 화학독립영양체를 배양하는데 있어서 종종 부딪히게 되는 문제는 충분한 양의 CO2를 공급해 주는 것이다. 비록 대기로부터 배지로 CO2가 확산되어 들어가 생장이 일어나도 록 해준다 하더라도 대기중의 CO2농도는 매우 낮으므로 독립영양체의 생장률은 이러한 상태하 에서 CO2의 유용성에 의해 제한받을 때가 가끔있다. 해결책은 인위적으로 풍부하게 CO2가 함유된 공기를 주입시켜 1 ~ 5%의 CO2가 들어 있게 하는 것이다. 이미 언급한 이유로 pH조절의 문제가 발생하는데, 만일 이 해결책을 채택한다면 배지의 완충액조성을 변화시키는데 세심한 주의를 기울여야만 한다. 뚜껑이 닫힌 병속의 혐기성 조건하에서 자랄 수 있는 독립영양체의 경우 CO2에 대한 요구는 배지에 NaHCO3를 첨가시켜 줌으로서 충족될 수 있다. 가용성 탄산염은 공기에 노출되는 배지에 사용해서는 안되는데, 그이유는 CO2가 대기중으로 급격히 소실되어 배지가 매우 염기성화되기 때문이다.

   6. 빛의 공급

     광영양성 미생물(조류, 광합성세균)의 배양을 위해서는 빛이 요구된다. 온도조절과 함께 충분한 빛을 조사하는 것은 단순한 문제가 아니다. 비광합성 생물체의 배양에 있어서 온도는 배양기를 사용하거나, 원하는 온도로 고정된 온도조절장치를 사용함으로써 조절될 수 있다. 그러나 상업 적으로 유용한 대부분의 모형은 내부조명계가 구비되어 있지 않으므로 광영양체의 배양에는 사용될 수 없다.

     배지를 일광에 노출시킴으로써 비교적 조절되지 않은 불연속적인 빛의 조사가 이루어질 수 있다. 태양광선에 직접 노출시키는 것은 강도가 너무 강하고 온도도 생장이 저해되는 정도까지 올라가므로 피해야 한다. 많은 광합성미생물들은 연속적인 광 조사에 견딜 수 있으며, 그들의 생장은 이러한 상태에서 더욱 빠르므로 인공적인 광원이 유리하다. 이용하는 광원의 방출 스펙트럼(emission spectrum)은 중요하다. 형광등은 비교적 적은 열을 방출하므로 실제적으로 유용하며 따라서 적정온도를 유지하기는 어렵지 않다. 그러나 그들의 방출스펙트럼은 태양광선에 비해 가시광선스펙트럼의 장파장과 적외선 근처의 파장에서 결손이 많다. 이들은 700nm보다 단파장의 빛을 사용하여 광합성을 수행하는 시아노박테리아를 배양하는 데는 적당하다. 그러나 750 ~ 1000nm범위에 있는 파장의 빛을 사용하는 홍색 및 녹색세균에게는 광합성에 효과 적인 빛이 되지 못한다.
     후자인 광합성 세균을 위해 적당한 인공광원은 백열전구이다. 그러나 높은광도로 사용되면 열의 방출이 문제가 된다. 가장 쉬운 해결책은 배양용기를 유리나 플라스틱 수조안에 담가두어 측면광조사를 받게 해주고, 물을 순환시킴으로서 원하는 온도를 유지시켜 주는 것이다. 다른 해결책으로는 내부 백열조명장치를 갖춘 광상자를 설계하여 그안의 온도를 통기나 냉각에 의해 조절하여 주는 것이다.