synthesis of DNA probe
특정 병원체나 유전자를 검출 또는 동정하기 위한 DNA 탐침은 수천 염기쌍의 크기로부터 인공적으로 합성한 짧은 단편(oligonucleotide: 20~40 base)에 이르기까지 다양하며 실험 목적에 따라 그 길이를 선택할 수 있다. 또한 탐침의 염기서열이나 표지방법도 목적에 따라 선택기준이 다르며 적절한 사용기준이 필요하다.
Probe란 우리말로 탐침자란 뜻으로 무엇인가 원하는 것을 찾아내는 역할을 하는 매개체를 가리키는 말이다. 유전자의 클로닝과 분석의 모든 과정에서 핵산의 혼성화 반응(hybrization)을 통한 실험이 수행되는데, 단일가닥의 유전자와 hybrid를 형성하는 probe에는 방사성 동위원소가 표지되어 있어 X-ray film을 통해 신호를 감지할 수 있다. 이와 같은 실험 방법들의 성공 여부는 클로닝 DNA에 얼마나 효과적으로 방사선 동위원소를 표지하느냐에 달려있다고 할 수 있다.
1. DNA chip(DNA probe)의 정의와 작동원리
DNA chip이란 DNA Chip은 microarray 혹은 BioChip이라고도 불리우며 유리판, nylon membrane등의 기판 표면에 탐침 DNA (probe DNA, cDNA 또는 Oligonucleotide)를 붙인 것을 일컫는다. DNA chip은 유리 같은 고체 기질 위에 많은 종류의 DNA를 높은 밀도로 집적시켜 붙여놓은 것인데, 일반적으로 1 ~ 20 cm2의 기판위에 서로 다른 DNA가 고정된 수천, 수만개의 pixel로 구성된다. 이때 고체 기질위에 붙여 놓는 DNA (oligonucleotide 또는 cDNA)를 probe DNA라 하고 검색하고자 하는 DNA를 target DNA라고 하는데, DNA chip은 이들 DNA 사이의 선택적인 혼성화를 통해 target DNA 내에 찾고자 하는 DNA의 sequence가 존재하는 지 또는 target DNA의 염기 배열을 밝히는데 사용된다.
DNA chip의 가장 큰 장점은 기존에 사용되었던 Southern과 Northern blot, 돌연변이 검색 그리고 DNA sequencing 방법들보다 훨씬 짧은 시간에 적은 시료를 가지고 많은 종류의 유전자를 검색할 수 있다는 것이다.
DNA chip은 고체 표면에 붙이는 유전 물질의 크기에 따라 cDNA chip과 oligonucleotide chip으로 나누어 질 수 있는 데, cDNA chip에는 최소한 500 bp이상의 유전자가 붙여져 있고, oligonucleotide chip에는 약 15 ~ 25개의 염기들로 이루어진 oligonucleotide가 붙여져 있다.
2. 탐침의 서열과 2차 구조
짧은 단일가닥 DNA로서, 보통 10~1000 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드이며,상보적인 뉴클레오티드 서열을 지닌 핵산 분자를 탐지하기 위해 잡종화 반응에 사용된다. 짧은 단일가닥 DNA는 비효소적인 방법으로 실험실에서 화학합성을 통해서 약 120 뉴클레오티드 길이 까지는 쉽게 만들어 낼 수 있다.
합성 DNA를 탐침으로 사용하는 경우 20~40 염기 정도 되는 것이 일반적으로 사용된다. 길이가 길어질수록 안정적이지만 비용과 특이성을 고려하여 이 정도의 길이를 사용하고 있다. 15염기 이하의 염기서열은 탐침 또는 합성개시물질(primer)로 적당하지 않다. 특이성을 디자인 할 때는 20염기의 합성 DNA의 경우 중심부에 1염기의 다른 서열이 있으면 식별할 수 있을 정도로 고안하여야 한다. 그러나 혼성화(hybridization) 온도 조건을 엄격히 하지 않으면 안되기 때문에 일반적으로 3염기 이상의 차이가 있는 서열을 사용하여 반응조건 설정을 쉽게 한다. 서열에 따라서는 그 위치에 따라서 사용할 수 없는 것이 있다. 예를 들어 20여기 중에서 5‘말단에 연소하여 3염기가 다른 서열이 있다고 해도 이 경우는 다른 서열과는 식별이 곤란하다.
3. 탐침제작
탐침은 DNAChip의 염기 서열과 서로 상보적인 서열을 갖고 있어 이들의 결합정도가 유전자의 발현량을 결정한다. 따라서 증폭하고자 하는 염기 서열은 다른 유전자와 유사성이 적고 해당 유전자에 특이적인 서열을 선택하여야 한다. 또한 mRNA 혹은 cDNA로부터 PCR 또는 RT-PCR을 통하여 탐침 제조 시 Scanner의 LASER 종류에 따라서 표식 하고자하는 형광 물질의 종류를 결정하여야 한다. 즉 Excitation wavelengths, Emission wavelenths 및 Emission filters를 고려하여야 한다. PCR 산물은 정제 하여 (PCR purification Kit Telechem) 사용하는 것이 낮은 background를 나타낸다.
또한 탐침에는 게놈의 한 자리에만 결합하는 단일탐침(single locus probe)과 복합탐침 (multilocus probe)이라는 다수의 과변이 지역에 동시에 결합하는 탐침이 있다.
4. 표지법
(1) Probe 제조에 이용되는 방사성 동위원소
일반적으로 방사성의 32P, 35S, 125I, 3H 등이 많이 사용되지만 동위원소를 이용한 DNA표지법은 취급상 어려운 점이 많고 반감기가 짧은 단점이 있기 때문에 근래 들어 DIG, Biotin, Fluorecein 등의 비방사성 탐침의 이용이 크게 늘어나는 추세이다.
1) 3H
specific activity가 가장 낮다. 반감기가 길다(12년). 방출되는 energy가 낮아 자가방사법에 사용되기는 어렵고 in situ hybridization 등에 이용된다.
2) 32P
가장 보편적으로 사용된다. 반감기가 짧다(14일).β-입자를 방출하여 가장 높은 specific activity를 가진다.
3) 35S
32 P보다 energy가 적고 specific acitivity가 낮다. 반감기는 87일이다.
(2) 핵산에 방사성 동위원소를 표식하는 방법
1) 핵산 전체를 균일하게 표식하는 방법
Nick translation
Random oligonucleotide primer를 이용한 방법
2) 5'-말단이나 3'-말단을 표식하는 방법 (End-labeling 방법)
Kination(end-labeling)
Filling-in(end-filling)
이중 nick translation은 이제 잘 쓰이지 않는다.
(3) 방사성 동위원소가 표식된 probe의 용도
1) cDNA 혹은 genomic DNA library로부터 특정한 clone을 찾아낼 때 흔히 방사성 동위 원소로 표지된 oligonucleotide나 cDNA probe를 사용하여 colony 혹은 plaque hybridization에 이용한다.
2) Genomic DNA의 특정 부위의 배열을 밝히기 위하여 cloning된 DNA의 일부를 probe로 하여 Southern hybridization을 시행한다.
3) 실험실에서 분리한 RNA에 특정 RNA가 포함되어 있는지, 포함되어 있다면 그 크기와 양은 어떠한지를 밝히기 위하여 cloning된 DNA의 일부를 probe로 하여 Northern hybridization을 시행한다.
(4) 효소반응을 이용한 표지법
1) Random primer를 이용한 DNA probe의 제조
DNA의 생합성은 단일가닥의 template에 결합된 primer로부터 DNA polymerase에 의해 시작된다. 만일 primer가 동일한 것이 아니고 여러 종류가 섞여있을 경우 이들은 template의 여러부위에서 hybrid를 형성하게 되고 결과적으로 template의 모든 nucleotide가 동일한 빈도로 합성되어 복제되게 된다. 이 방법에 의하여 [α-32P]dNTP를 전구물질(precursor)로 사용하여 DNA에 매우 높은 specific activity로 동위원소를 표지할 수 있다. 최근에는 비방사성 원소를 사용하여 DNA 혹은 RNA를 표식하는 방법이 개발되어 많이 사용되어지고 있다.
2) Kinase를 이용한 end-labeling
DNA 조각의 한쪽(5' 또는 3'쪽)끝에 동위원소를 표지하는 방법을 end-labeling이라 하는데 이중 kinase 효소를 이용하여 [γ-32
P]ATP를 5'쪽 phosphoryl기에 치환시키는 방법을 kination이라 한다. 이 방법은 single strand DNA에도 적용될 수 있어 synthetic oligonucleotide를 이용하는 경우에도 쓸 수 있다. T4 polynucleotide kinase의 활성은 DNA의 5'쪽의 형태(protruding-end, blunt-end, recessive-end)에 따라 다르게 나타나므로 가능하면 활성이 높은 protruding-end를 이용할 수 있도록 실험을 디자인해야 한다.
3) Klenow 효소를 이용한 end-filling(filling-in)
Filling-in이란 Klenow 효소를 이용하여 3'-쪽 끝에 방사능을 지닌 DNA를 만들어 주는 방법이다. 제한효소를 사용하여 5'-overhang이 된 DNA에 방사능을 지닌 한가지(보통 dCTP)의 염기와 방사능을 지니지 않은 세가지 염기를 첨가하여 Klenow 처리하면 표지된다. 이 방법은 자신이 원하는 부분에 정확히 표지할 수 있는 장점이 있지만 random primer를 이용한 경우보다 표지되는 동위원소의 수가 적기 때문에 DNA 몰수 당 specific activity가 적다는 단점이 있다. DNA 두가닥 중 한 가닥에만 특이적으로 표지해야 하는 DNase I footprinting이나 Maxam-Gilbert sequencing에 이용하는 probe는 이 방법을 이용할 수 있다.
5. Hybridization
만약 DNA를 열이나 알칼리로 처리하면 변성(denaturation)되어 이중나선 가닥들이 분리된다. 분리된 상보적인 단일가닥들은 다시 온도를 낮추거나 중성의 pH로 중화하면 서로 재결합(renaturation)한다. 이때 외부에서 상보적인 서열을 지닌 DNA나 RNA를 첨가해주면 이들과도 이중나선을 이룰 수 있는데 이를 혼성화(hybridization)라고 한다. 이러한 성질을 클론의 선별에 이용할 수 있다. 혼성화법을 이용한 선별에 사용되는 DNA, RNA, cDNA, 올리고뉴클레오티드 등을 탐침이라고 하는데 혼성화 여부를 쉽게 확인할 수 있도록 방사성 동위원소로 표지를 하거나 여러 비방사성 표지 방법을 이용하여 표지하여야 한다.
표지한 탐침이 준비되면 Grunstein과 Hogness가 개발한 집락 혼성화(colony hybridization) 방법을 사용하여 많은 클론의 상동성(homology)을 동시에 검사할 수 있다.
각 클론의 집락을 nitrocellulose(또는 nylon) 여과지 위에서 키우거나 또는 이러한 여과지를 평판배지위에 덮고 가볍게 문질러 집락을 배지로부터 막으로 이동시킬 수 있다. 이러한 집락들은 실험 과정중에 용균되어 버리기 때문에 초기 평판배지 혹은 복제판을 보존하는 것이 필수적이다.
이 여과지를 NaOH로 처리하여 세포를 용해하고 DNA를 변성시킨다. 이렇게 변성된 DNA는 떨어지지 않도록 구워서 고정한다. 표지된 탐침을 끓여 변성시키고 적절한 완충용액과 함께 고정한 여과지에 가하여 하룻밤 동안 배양한다. 탐침이 상보적인 염기서열을 찾아서 결합하면 여과지를 깨끗이 씻어서 결합하지 않은 탐침을 제거한 다음 autoradiography하여 결합된 탐침의 위치를 확인한다. 이 위치와 일치하는 평판배지의 클론을 선발한다.
이러한 방법의 발달로 인하여 작은 숫자의 평판배지에서 수십만개의 집락을 선별해내는 것이 가능해졌다. 파아지 운반체를 사용할 경우 이러한 방법의 간단한 변형으로 원하는 용균반(plaque)을 효과적으로 선별할 수 있다. 이를 용균반 혼성화법이라고 한다.
실험 시 Cover glass 밑에서 소량의 probe를 사용하여 이루어지므로 Hybridization cassette (Telechem)를 사용하여 시험 도중 probe의 건조를 방지하여야 한다. Target DNA의 양이 probe보다 약 10배 이상 유지되어야 발현되는 양의 linearity를 확인할 수 있다. 또한 monovalent cation은 Heteroduplex의 형성에 도움을 주므로 최적의 상태를 선택하여야 한다. hybridization 온도는 염기 서열에 따라 다르므로 경험적으로 결정하여야 하나 일반적으로 oligomicroarray (25 - 42 ℃)가 cDNA microarry (55 - 70 ℃)보다 낮은 온도에서 진행된다.
(1) Hybridization Probe
Hybridization Probe Fomat에서 두개의 sequence specific oligonucleotide probe는 서로 다른 dye(donor와 acceptor)로 labeling되어 있는데 이는 head에서 tail manner로 target sequence에 hybridize되기 위해 선택되어진다. donor dye는 빛에 의해 흥분되어 형광빛을 띠게 된다. acceptor dye가 근접하면 이 형광빛은 second Hybridization Probe에 부착된 acceptor dye를 흥분시켜 이것이 다른 파장에서 형광빛을 발하게 된다. FRET(fluorescence resonance energy transfer)라고 불리는 이 과정은 dye가 근접하였을 때만 효과가 있다(그림 A). 이 방법을 약간 변형시킨 또다른 방법으로는 acceptor dye와 내적으로 labeling된 PCR-amplification primer를 이용하는 것이 있다(그림 B). Hybridization Probe Format은 LightCycler를 이용하여 SNP를 genotyping하거나 mutation을 분석하는데 효과적이다.
6. 탐침의 이용
(1) nucleic acid probe (핵산탐침)
nucleic acid probe (핵산탐침)은 특정한 유전자를 확인하는 데 유용하다. 핵산 혼성화법을 사용하여 특정 DNA 및 RNA 서열을 확인 할 수 있다.
DNA 이중나선은 열에 약하여 열을 가하면 한 가닥 DNA 사슬로 나뉘어진다.(DNA denaturation(변성)) 변성된 DNA를 다시 합칠 때, 일부의 염기배열과 상보적인 한 가닥 DNA 조각을 넣어주면 상보적인 DNA지역에 가서 결합한다.(DNA hybridization) 이 때 만일 이 DNA 조각을 방사능 등으로 표지하면, 그 조각에 상보적인 염기배열이 존재하는지를 알 수 있다. 이것을 분자 탐침(molecular probe)라 한다. 이 DNA hybridization 방법을 이용하여 genomic library 등에서 원하는 유전자를 가진 대장균을 확인 할 수 있으며, 유전자 클로닝이 가능하다.
(2) 단백질 확인을 위한 항체 탐침
항체는 특정 단백질을 확인하는 탐침으로 사용된다.
(3) 재조합 DNA라이브러리 선별용 탐침
인간 게놈의 라이브러리에서 목적하는 유전자를 찾아내기 위해서는 DNA 잡종화를 이용해야 하는데, 이를 위해서는 DNA probe가 필요하다. DNA probe를 이용한 잡종화실험에 의해서 이 탐침에 상보적인 인간 DNA를 가진 소수의 박테리아 클론들이 확인될 수 있다.
또한 특정 DNA가 삽입된 것은 재조합 DNA 라이브러리에서 핵산 혼성화법이나 항체 탐침을 사용하여 검출 할 수 있다.
게놈과 cDNA 라이브러리는 한 번 만들어지면, 특정 DNA 삽입체를 가지는 재조합 클론들을 핵산 혼성화(hybridization)에 의해 밝혀낼 수 있다. DNA를 가지고 있는 클론이나 용균반을 검색으로 알기위해 특정 DNA 서열이 탐침자로 사용된다. DNA 탐침자는 목표 DNA에 상보적이어서 염기쌍을 이룰 수 있게 만들어 DNA 혼성체가 된다. -첫 번째 막을 처리해서, 집락의 세포를 녹이고 세포 찌꺼기는 제거함.→남아있는 DNA를 단일가닥으로 변성시켜 DNA 탐침자와 상보적인 염기쌍을 유리시켜서 혼성화를 만들어 이를 방사능이 있는 탐침자나 방사능이 없는 형광물질이나 염색으로 표지하여 혼성화를 확인함.
References
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