SDS-PAGE

Protein Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

전기영동원리
Acrylamide를 가교제 (cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용돼 왔다.

Polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 기능기가 N,N'-methylene bisacrylamide와 같은 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 비가역적으로 중합되어 형성된 polymer이다 (그림1).



가교제로는 N,N'-methylene bisacrylamide이 (일반적으로 bisacrylamide라 한다) 많이 사용되고 있으며, 또는 N,N'-bisacrylylcystamine (BAC), N,N'-diallyltartardiamine (DATD), Ethylene diacrylate (EDIA) 등도 특수한 목적으로 사용되기도 한다.

생체물질의 효과적인 분리 범위는 polyacrylamide의 농도와 가교제와의 중합 정도에 의해 결정되며 가교제에 의해 중합되어 생긴 gel은 적절한 강도와 탄성을 유지하고 polypeptide가 통과할 작은 구멍을 형성한다. 이 구멍의 크기는 가교제와 polyacrylamide의 비율이 증가할수록 감소하여 약 1:20 정도에서 가장 작게 된다. 대부분의 polyacrylamide gel은 1:29의 몰 비율로 제조하며 사용하고 있으며 이 비에서 분자량이 3% 정도의 차이가 있는 polypeptide를 분리할 수 있다.

Polyacrylamide gel은 %T와 %C로 표현되는데 %T는 acrylamide와 bisacrylamide의 %중량이며 %C는 가교제인 bisacrylamide의 %중량이다. 따라서 %T와 %C가 커지면 그만큼 미세통로의 크기는 작아지게 되어 작은 물질의 분리에 이용할 수 있게 된다.

Acrylamide의 중합은 ammonium persulfate (APS) 또는 riboflavin의 첨가에 의해 개시된다. APS를 사용하는 경우에는 촉매제로 N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)를 사용하며 TEMED는 persulfate로부터 자유라디칼의 생성을 촉매함으로써 중합을 개시한다. Riboflavin은 광조사 (photoactivation)에 의해 자유라디칼을 생성하여 acrylamide의 중합을 개시한다. Polyacrylamide의 중합이 해리된 자유라디칼에 의해 시작되므로 gel용액 내의 산소는 중합반응을 방해하게 되는데 gel용액을 사전에 degassing 해주는 이유이다.

Polyacrylamide gel을 사용하는 단백질 전기영동법은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데 하나의 gel만을 사용하는 연속적 시스템(continuous buffer system)과 buffer조성이 다른 두 개의 겔을 사용하는 불연속적 방법이다 (discontinuous buffer system). 연속 시스템은 pH 3-11 사이의 완충용액을 한가지 선택하여 겔과 음전극액 내 전해질 조성 및 농도를 동일하게 만들어 전기영동하는 방법이고 불연속 시스템은 흔히 우리가 알고 있는 stacking gel을 사용하는 경우이다. 또한 단백질 전기영동법은 ionic detergent의 사용유무에 따라 dissociating 또는 non-dissociating 법으로 구분하기도 한다. Dissociating법은 sodium dodecyl sulfate (SDS)와 같은 ionic detergent나 수소결합을 끊어주는 urea등을 단백질 시료에 첨가한 후 열을 가해 denature시킨 후 단백질복합체를 개별 단백질로 해리하여 분석하는 방법으로 disufide bond를 해리 시켜주는 reducing agent (b-mecaptoethanol 또는 DTT)의 사용유무에 따라 reducing 또는 non-reducing법으로 구분하기도 한다. Non-dissociating 법은 단백질변성을 주지 않고 단백질 복합체를 단백질의 고유한 전하에 의해서만 분리하는 방법이다 (흔히 Native PAGE라고 한다).

단백질 분리를 위한 전기영동에 있어서 오늘날 가장 광범위하게 쓰이고 있는 SDS-불연속 전기영동법(SDS-discontinuous polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)은 1970년 Laemmli, U.K.에 의해 개발되었다(Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685). 불연속 전기영동법의 가장 큰 장점은 많은 용적의 시료를 로딩하더라도 좋은 해상도로 얻을 수 있다는데 있다.

전기영동용 완충용액(running buffer)에 포함된 glycine은 의가약산으로서 음전하와 양전하를 동시에 띨 수 있다. 이와 같은 zwitter이온의 성질을 이용하면 gel내의 pH조건에 따라 glycine의 net charge와 이로 인한 전기영동속도를 조절할 수 있다. 전기영동을 시작하면 leading 이온인 Cl-이온과 단백질, glycine이온이 모두 양극을 향해 출발하게 된다.

Glycine은 stacking gel의 낮은 pH 조건에서는 거의 중성을 띠므로 국부적인 전류의 감소현상이 유발된다. 따라서 낮은 pH 조건에서도 이동도가 빠른 Cl-이온과 이동도가 느린 glycine 이온 사이에 매우 높은 전위차가 형성되는데 이러한 전위차에 위해 glycine이온이 Cl-이온을 빠르게 뒤따르게 된다. 이때 상대적인 이동속도는 glycine < 단백질 < Cl-이 되며 따라서 단백질은 Cl-와 glycine 이온사이에 축적되어 이동하게 된다. Cl-와 glycine 이온의 간격은 수 mm로서 많은 용적의 시료에 있던 단백질도 running gel에 들어가 기전에 이사이에 축적되어 해상도를 높이는 효과를 나타내게 된다. Stacking gel은 large-pore gel이므로 단백질의 molecular sieving현상은 나타나지 않는다 (gel내의 미세통로 크기에 따라 단백질이 분리되는 현상).

이동 중인 이온들이 running gel에 이르게 되면 running gel의 높은 pH는 glycine이온을 음전하로 강하게 대전시켜 glycine의 이동속도가 단백질보다 빠르게 되며 단백질은 gel내에서 molecular sieving현상에 의해 분리된다.

Stacking gel은 acrylamide 농도가 3~5%인 것을 사용하며 pH는 6.8이다. Running gel (resolving gel 또는 separating gel)은, 분리하고자 하는 단백질의크기에 따라 6~15%를 주로 사용하며 pH는 8.8이다 .

 

SDS-PAGE (Laemmli's discontinuous) 방법

SDS-PAGE (Laemmli's discontinuous) 방법

Materials

1.5 M Tris-HCl, pH 8.8	18.17g Trisma base in 100ml DW and adjust pH with HCl
1 M Tris-HCl, pH 6.8	12.11g Trisma base in 100ml DW adjust pH with HCl
10% SDS	10g/100ml DW
TEMED
10% Ammonium persulfate	1g/10ml DW, fresh prepare
30% acrylamide/bisacrylamide stock solution (29:1 mix)	29g acrylamide (ultra pure) 1g bisacrylamide dissolve in 100ml DW and filter store at 4℃ in dark
2x Sample Loading Buffer	125 mM Tris-HCl, pH 6.8 20% Glycerol 2% b-mecaptoethanol 0.04% bromophenol Blue 4% SDS
Running Buffer (1x)  10x로 만들어 장기 보관할 수 있다	0.025M Tris-HCl (pH8.3) 0.192M Glycine 0.1% SDS
Coomassie R250 Staining Solution	1g Brilliant R250 450ml Methanol 100ml Glacial acetic acid 450ml DW
Destaining Solution	450ml Methanol 100ml Glacial acetic acid 450ml DW

Gel PreparationRunning gel %의 선택 (이동도 보기)5%            100-300Kda7.5%          40-250Kda10%           20-200Kda12%           14-150Kda15%             4-100KdaResolving Gels

7.5%	5 mL	10 mL	20 mL	30 mL	40 mL	50 mL
H2O	2.40	4.8	9.6	14.7	19.2	24.0
1.5M Tris-HCl	1.25	2.5	5.0	7.5	10.0	12.5
30% Acryl/bis-Acryl	1.25	2.5	5.0	7.5	10.0	12.5
10% SDS	0.05	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
10% APS	0.050	0.100	0.200	0.300	0.400	0.500
TEMED	0.004	0.008	0.016	0.024	0.032	0.040

 

10%	5 mL	10 mL	20 mL	30 mL	40 mL	50 mL
H2O	1.92	3.97	7.93	11.9	15.86	19.83
1.5M Tris-HCl	1.25	2.5	5.0	7.5	10.0	12.5
30% Acryl/bis-Acryl	1.67	3.33	6.67	10.0	13.33	16.67
10% SDS	0.05	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
10% APS	0.050	0.100	0.200	0.300	0.400	0.500
TEMED	0.002	0.004	0.008	0.012	0.016	0.020

 

12%	5 mL	10 mL	20 mL	30 mL	40 mL	50 mL
H2O	1.65	3.3	6.6	9.9	13.2	16.5
1.5M Tris-HCl	1.25	2.5	5.0	7.5	10.0	12.5
30% Acryl/bis-Acryl	2.0	4.0	8.0	12.0	16.0	20.0
10% SDS	0.05	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
10% APS	0.050	0.100	0.200	0.300	0.400	0.500
TEMED	0.002	0.004	0.008	0.012	0.016	0.020

 

15%	5 mL	10 mL	20 mL	30 mL	40 mL	50 mL
H2O	1.15	2.3	4.6	6.9	9.2	11.5
1.5M Tris-HCl	1.25	2.5	5.0	7.5	10.0	12.5
30% Acryl/bis-Acryl	2.5	5	10	15.0	20.0	25.0
10% SDS	0.05	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5
10% APS	0.050	0.100	0.200	0.300	0.400	0.500
TEMED	0.002	0.004	0.008	0.012	0.016	0.020

Stacking Gels

5%	1 mL	2 mL	4 mL	5 mL	10 mL
H2O	0.688	1.337	2.753	3.442	6.885
1M Tris-HCl (pH6.8)	0.125	0.25	0.5	0.625	1.25
30% Acryl/bis-Acryl	0.167	0.333	0.667	0.833	1.67
10% SDS	0.01	0.02	0.04	0.05	0.1
10% APS	0.010	0.020	0.040	0.050	0.100
TEMED	0.001	0.002	0.004	0.005	0.010

casting & Running (Denaturing SDS-PAGE)

1. 전기영동 키트의 고유한 방법에 따라 유리판을 casting한다.

2. Stacking gel과 running gel 용액을 준비한다 (Gel preparation). Mini-gel (10x8cm, 0.75mm thick)의 경우 running gel 4 ml과 stacking gel 0.6 ml이 소요된다.

3. Running gel 용액에 ammonium persulfate와 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않을 정도로 신속히 섞고 pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓는다.

4. Stacking gel의 높이를 고려하여 running gel용액을 부어준 후 그 위에 증류수 또는 alcohol (ethanol, butanol, isopropanol 등 어떤 것도 좋으며 ethanol이 가장 보편적이다 ?냄새가 친근하니까)을 조심스럽게 가해준다 (이는 running gel의 윗표면을 고르게 해주는 효과 외에 공기를 차단하여 gel이 고르게 중합되게 하기 위한 것이다). Gel이 굳을 때까지 방치한다.

5. Gel이 굳으면 상층에 가한 ethanol과 acrylamide사이에 뚜렷한 경계가 보이는데 이때 ethanol을 제거하고 증류수로 수차례 앃어준다.

6. 미리 준비해 놓은 stacking gel 용액에 ammonium persulfate와 TEMED를 첨가한 후 신속히 섞고 pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 붓고 comb을 끼운다.

  주의 : gel 내부, 표면, comb과 gel 사이의 기포는 좋은 전기영동결과를 얻는데 치명적이므로 세심한 주의가 필요하며 특히 comb밑의 기포를 주의해야 한다. 기포는 gel 용액에 첨가한 SDS에 의해 더욱 심해지므로 gel 용액에서 SDS를 생략하는 것도 고려해 볼만하다

8. Gel이 다 굳으면 조심스럽게 comb을 빼낸 후 형성된 well을 증류수로 여러 차례 세척한다.

9. Casting한 gel을 전기영동장치에 장착하고 전기영동용 완충용액을 위와 아래의 완충용액탱크에 붇는다.

10. Well에 조심스럽게 시료를 가한다.

   주의 : 사용하지 않는 well에도 시료와 같은 용량의 1x sample loading buffer를 가하는 것이 좋다.단백질의 양이 많은 경우에 단백질 이동 lane이 퍼짐으로써 왜곡되는 경우를 방지하기 위함.

11. 전기영동 기구를 전원에 연결시킨 후 정전압 또는 정전류에서 전기영동을 한다. Mini-gel의 경우에 100V 정전압에서 1시간 30분이 소요되며 과도한 열발생이 되지 않는 한 200V 이상도 가능하다.

13. 이동지표인 bromophenol blue가 gel의 끝부분에 도달하면 전원을 내리고 전기영동 장치로부터 유리판을 분리한다.

15. Gel을 고정하거나, Coomassie brilliant blue로 염색하거나, 형광사진의 촬영 또는 Western blot 등 용도에 따라 이용한다.

   !!! 주의사항 !!!

    Acrylamide와 bisacrylamide는 피부로 흡수되어 매우 강력한 신경독성을 나타내며 이 효과는 축적되기 때문에 무게를 잴 때는 장갑과 마스크를 차용해야 한다. 일단 굳은 polyacrylamide는 무해하다고 여겨지지만 polymer 형성이 안된 acrylamide 또는 bisacrylamide monomer가 남아 있을 수 있으므로 조심스럽게 다루어야 한다.

Gel Staining/Destaining (Coomassie Brilliant R250)

1. 전기영동이 끝난 후 gel을 조심스럽게 gel판으로부터 분리한 후 플라스틱 또는 유리용기 (시장에서 살 수 있는 반찬통이 적합)에 옮기고 staining solution을 붇는다 (gel volume의 5배 정도가 적당, 10x8 cm mini-gel인 경우에 25ml 정도)

2. Shaker에 올려놓은 후 30분-1시간 염색한다 (전반적으로 gel이 파랗게 보이고 단백질 밴드가 좀더 진하게 보이는 상태가 가장 좋다).

    주의 : staining/destaining 용액에는 과량의 methanol이 들어 있으므로 뚜껑을 잘 닫아주지 않을 경우에 methanol이 증발하여 염색이 잘 되지 않을뿐더러 gel의 크기가 커진다.

3. 수도물로 가볍게 세척해 주고 destaining solution을 부어준 후 shaker에 올려 놓은다.

4. Destaining solution을 수차례 교환하면서 gel의 염색시약이 모두 빠지도록 한다.

 

Troubleshooting

 

1. Gel이 전혀 굳지 않는다.
     APS가 만든지 오래된 경우 나타날 수 있는 전형적인 경우로 새로이 APS를 만들어 사용한다.
2. Gel이 굳기는 하지만 강도가 적어 마치 점액질 액체같다.
     Acrylamide와 bisacrylamide의 농도와 비율이 적합하지 않은 경우에 나타날 수 있으며 gel용액에 불순물이 많은 경우도 있을 수 있다. 또한 산성조건에서는 APS에 의한 자유라디칼 생성이 방해를 받으므로 gel이 굳는 속도가 늦어질 수 있다. Gel을 굳히는 실내 온도가 낮아 gel이 굳는 속도가 늦어질 수 있다.
      Acrylamide의 deamination에 의한 경우도 있을 수 있으므로 stock solution은 빛이 차단된 밀폐용기에서 저온으로 잘 보관해야 하며 1년 이상된 용액은 예비실험이 꼭 필요하다.
3. Gel의 표면이 갈라진다.
      High % gel에서 흔히 발생하는 문제로 중합속도가 너무 빨라 생성되는 열이 많은 경우이므로 차가운 용액을 사용하거나 APS와 TEMED의 첨가량을 조절하여 굳는 속도를 늦추면 된다. (polyacrylamide의 중합반응은 발열반응이다).
4. Well형성이 잘되지 않는다.
      Comb은 polyacrylamide의 중합을 방해하는 Teflon재질로 만드는 것이 일반적으로 이는 comb와 유리판 사이의 gel이 중합되는 것을 최대한 막기 위한 것이다. 과다한 APS를 사용하는 경우에는 comb과 유리판사이에서도 앏은 막의 형태로 중합이 이루어지므로 세심한 주의가 필요하다. APS의 양이 적은 경우에는 well 벽이 없어지는 경우도 있다.
5. 유리판에서 gel이 잘 떨어지지 않는다.
     유리판에 묻어있는 오염물때문인 경우가 많으므로 유리판을 잘 세척해 주어야 한다.
6. 단백질 시료의 로딩이 안되고 퍼져 버린다.
     Sample loading buffer에 침강제인 glycerol이나 sucrose가 빠진 경우이다.
7. 단백질이 well에 걸린다.
    대부분이 insoluble protein에 의한 것으로 protein streaking으로 나타난다.
    1) Sample loading buffer, running buffer의 ionic strength가 낮거나 (buffer에서 단백질침전이 일어나는지 확인이 필요)
    2) Insoluble protein이 포함되어 있거나 (원심분리로 제거)
    3) 단백질 정제과정에서 buffer의 pH가 낮아졌거나
    4) 과도한 양의 단백질을 로딩했거나
    5) Buffer내에 SDS나 reducing agent의 양이 적을 경우에 발생할 수 있다.
8. 단백질 밴드가 끌린 형태이다.
    Gel내에 먼지나 기포가 있는 경우 또는 7번에서처럼 단백질의 불용성이 원인이 되어 나타날 수 있다.
9. 명확한 단백질 밴드가 보이지 않고 전반적으로 smear되어 나온다.
    시료가 단백질분해 효소에 오염되어 단백질들이 심하게 분해된 경우이다.
10. 전기영동이 전혀 되지 않거나 영동속도가 무척 느리다.
    Laemmli 방법을 사용하는 경우에 있어 100V 정전압에서 이동속도는 평균적으로 1.5 hr로서 2시간이상 시간이 소요된다면
    1) Running buffer의 이상유무
    2) Acrylamide용액의 변성 유무를 확인해 봐야 한다.
    Acrylamide는 높은 pH에서 가수분해되어 amine기가 해리되어 떨어진다. 이는 gel 용액의 pH를 바꿈으로써 buffering 기능을 방해하여 비정상적인 전기영동을 초래할 수 있다. 따라서 acrylamide stock용액의 pH는 중성을 유지해야 한다.
11. Master mix gel 용액을 만들어 사용할 수 있는지?
    Stacking gel 용액의 pH는 6.8이므로 acrylamide의 변성이 최소화되어 모든 성분이 포함된 상태로도 오래 보관할 수 있으므로 master mix의 제조가 가능하나 running gel용액은 pH가 8.8이므로 사용할 때마다 혼합하여 제조해야 한다. 단 2x buffer mix와 2x acrylamide stock solution을 따로 제조하여 장기적으로 보관하면서 사용할 수 있다.
      Gel 용액을 3가지
        1) Stacking gel mix (모든 성분을 미리 혼합)
        2) 2x running gel buffer (acrylamide를 제외한 모든 성분을 혼합)
        3) 2x acrylamide stock
      으로 냉장보관하면서 사용하면 과다한 피펫팅으로 인한 피로를 줄일 수 있다.
12. Gel용액에 SDS를 넣지 않아도 괜찮은지?
     SDS를 빼도 해상도에는 큰 영향을 주지 않으며 오히려 SDS로 인한 기포생성 등을 줄일 수 있다.
13.단백질 밴드의 smiling현상이나 측면에 끌림 현상이 나타난다.
    단백질 로딩양이 많거나 stacking gel부위가 짧은 경우, 전기영동시 온도가 과도하게 올라간 경우에 일어날 수 있다. 끌림 현상은 핵산등 high charge, high molecular mass를 갖는 물질들에 의해 일어날 수 있다. 잘 정제된 단백질을 사용하고 로딩하는 시료의 양을 줄이는 방법이 최선이다.
14. Coomassie염색정도가 약하다.
    단백질의 양이 적은 경우일 수도 있고 staining 용액이 적어 나타날 수도 있다. Gel내의 SDS는 단백질 염색을 방해하므로 staining 용액으로 충분히 희석 시켜주어야 하며 염색을 2차례에 걸쳐 하면 염색강도가 증가한다.
15. Coomassie염색시 background염색정도가 심하거나 destaining이 잘 되지 않는다.
    Gel의 표면에 oil등이 오염된 경우로 gel plate와 staining용기를 잘 세척해 주어야 한다. 특히 맨손으로 gel을 다룰 때 data에는 실험자의 지문이 영구 보존된다.
16. 염색 전에 전기영동이 잘 되었는지 확인해 볼 방법은 없는지?
    한쪽 유리판만을 뗀채 gel표면을 전등빛에 비슴듬히 비추면 gel내에서 단백질이 있는 부위와 없는 부위의 및 굴절률이 다르므로 단백질 밴드를 확인해 볼 수 있다.
17. Gel을 말리는 과정에서 gel이 잘 갈라진다.
    %농도가 높은 gel에서 자주 일어나는데 destaining후 증류수에서 일정시간 동안 swelling해주면 된다.
18. 전기영동시 bromophenol blue의 색이 노랗게 변한다.
      양극에서 생성되는 H+ 이온이 과도하여 양극에 있는 running buffer의 pH가 내려간 경우로서 running buffer의 조성을 체크해 봐야한다.