[생명공학] PCR

PCR(polymer chain reaction)은 DNA의 원하는 부분을 증폭하는 방법이다. DNA molecule의 어느 부분이든지 그 border sequence만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 기본적으로 denaturation, annealing, extension의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. 기본적으로 PCR을 구성하고 있는 요소들에는 DNA template, primer, dNTP, polymerase등이 있으며, PCR 과정에서 그것의 sensitivity와 accuracy에 가장 영향을 미치는 것은 primer와 temperature이다.

 

1. PCR의 각 과정

 

(a) Denaturation

 

PCR의 가장 첫 단계이며, 온도가 높아짐에 따라 DNA의 염기 사이에 있는 수소결합이 끊어져 두가닥의 DNA가 분리된다. 일반적으로 94℃ 정도에서 1분간 진행된다.

 

(b) Annealing

 

각각 두가닥으로 분리된 DNA molecule에 primer가 붙는 과정이다. Primer는 그들과 상보적인 염기를 가지고 있는 DNA 서열에 달라붙는다. 이 과정이 바로 PCR의 accuracy를 결정짓는 단계이며, 어느 온도로 진행되는 가는 primer의 길이와 그것을 이루고 있는 염기의 종류에 따라 달라진다. 만약에 온도가 너무 높으면 primer가 DNA molecule에 잘 달라붙지 않아 그 효율이 떨어지며, 반대로 온도가 너무 낮을 경우에는 primer가 mismatch할 확률이 높아서 정확도가 그만큼 더 떨어진다. 일반적으로 온도는 아래의 식에서 결정되며, 여기서 trial & error 과정을 포함하여 좀 더 구체적으로 결정한다.

 

Tm = (4*[G+C]) + (2*[A+T])℃

 

여기서 G+C의 계수가 더 큰 이유는 그들이 A+T의 수소결합 보다 센 수소결합을 하기 때문이다.

 

(c) Extension

 

Primer로부터 DNA가 뻗어나가는 과정이다. 물론 template와 상보적 결합으로 인하여 뻗어나간다. 이때는 보통 74℃에서 2분간 진행되며, 이 온도가 Taq polymerase의 활성이 최대로 되는 온도이다.

2. PCR의 구성요소

 

(a) Primer

 

PCR의 가장 중요한 요소이며, 정확도를 결정한다. Primer의 길이는 너무 길어도 안되며 너무 짧아도 안된다. 너무 짧다면 인간의 genome처럼 많은 양의 nucleotide로 구성된 DNA molecule을 대상으로 할 경우, primer가 인식할 수 있는 site가 너무 많아서 원하는 부분만을 증폭하는 것이 불가능해진다. 반대로 너무 길다면 PCR 과정에서 DNA가 hybridizing할 때의 시간이 많이 걸려, 그 효율이 떨어진다. 일반적으로 17-30mer가 primer의 크기로 적당하다.

 

(b) polymerase

 

PCR에서 사용하는 polymerase는 Taq1 polymerase로 이것은 Themus aquaticus로부터 추출한 효소이다. 이 생명체는 바다 밑의 뜨거운 곳에서 사는데, 이 때문에 이 생물의 효소는 열에 저항성이 있다. 따라서 Taq1 polymerase 역시 열에 저항성이 높다. 이러한 성질이 PCR에서 이 polymerase를 쓰는 이유이다. 보통 PCR을 할 경우, denaturation 과정에서 온도가 94℃까지 올라가며, 대부분의 단백질은 이 온도에서 변성이 되어 그 기능을 상실한다. 하지만 Taq1 polymerase는 열에 저항성이 높기 때문에 이 온도에서도 변성이 되지 않는다

 

3. Studying PCR products

 

PCR은 일반적으로 긴 실험에서 첫단계로 많이 사용된다. 일반적으로 PCR의 product는 다음의 세가지 방법 중에 하나에 의해서 분석된다.

 

Agarose gel electrophoresis.

Direct sequence analysis of the PCR product.

Analyses that involve cloning the PCR product.

 

4. PCR의 종류

 

1) RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)

 

특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, (2) 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 Northern blot hybridization과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR을 통해서 전체 길이의 cDNA를 간단하게 합성하여 cloning 할 수 있다.

 

실험방법

 

1. 다음과 같이 시료를 혼합한다.

RNA 11 ml

Random nomamer 1 ml

u Total RNA는 1~5 mg, mRNA는 50~500 ng을 쓰면 되는데, 보통 1 mg의 total RNA로 충분하다. RNA의 분리는 이 책의 다른 장에 기술되어 있는데, 요즘에는 간단히 RNA를 분리할 수 있는 kit가 많다. 어떤 kit로 분리하든 관계없으나, RT-PCR에 이용할 경우 DNA의 contamination이 있지 않도록 주의하여야 한다. 실험자에 따라서 DNase I을 처리하여 사용하는 사람도 많다.

u Primer는 oligo(dT) primer, random primer, 또는 gene specific primer를 사용할 수 있다. 보통의 경우라면 random primer를 권한다. Random nomamer 또는 random hexamer는 Bioneer 사 등에서 합성(염기서열 5'-NNNNNNNNN-3'으로 주문)하여 사용한다. 50~250 ng을 이용하면 되는데, 대개 100 ng/ml로 희석해 놓고 1 ml 씩 반응에 이용한다. 사용 전 25°C 또는 상온에 10분 두었다가 쓴다.

 

2. 70°C에 10분 두었다가 곧바로 얼음에 옮긴다. 간단히 원심분리하여 바닥에 시료를 모으고 다음과 같은 시약을 첨가한다.

5x first strand buffer 4 ml

0.1 M DTT 2 ml

10 mM-each dNTP 1 ml

SuperscriptTM II (200 units/ml) 1 ml

u 이 과정은 첫번째 가닥의 cDNA를 만드는 역전사 과정으로 reverse transcriptase(RT)를 요한다. 이 효소는 AMV-RT, MMTV-RT 등이 있는데, superscript II는 cDNA의 합성을 보다 효율적으로 할 수 있고 RNase가 오염되지 않은 RT로 Gibco 사에서 구입할 수 있다.

 

3. 42°C에서 50~60분 반응시키고 70°C에서 15분 두어 효소를 불활성화 시킨다. 대부분의 경우 이 반응물을 2~10 ml template로 하여 직접 PCR 반응에 이용할 수 있다. 그러나 PCR 하고자 하는 gene의 크기가 1 kb 이상인 경우에는 다음 과정을 첨가하는 것이 좋다.

 

4. E. coli RNase H(2 units/ml) 1 ml를 첨가하고 37°C에서 20분 반응시킨 후 phenol/chloroform extraction 또는 QIAquick column 등을 이용하여 purification한다.

 

5. 과정 3 또는 과정 4의 반응물을 template로 하여 PCR 반응을 시행한다.

 

2) SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)

 

어떤 입자들의 전기장 내에서의 이동속도는 그 입자의 크기와 형태에 영향을 받는다. Single strand DNA는 non-denaturing 조건하에서 분자내의 상호작용에 의하여 2차 구조를 형성하게 되는데 이 2차 구조는 DNA의 염기서열에 의하여 결정돤다. 그러므로 DNA 염기서열중 하나의 염기서열의 변화(point mutation, deletion 또는 insertion)에 의해서도 전기영동상 전개되는 속도에 영향을 받으므로 이동거리에 차이가 발생하게 된다. 이와 같은 원리를 바탕으로 1989년 Orita 등에 의하여 고안된 SSCP는 유전자의 돌연변이를 검색하는 유용한 도구로서 사용되고 있다.

 

최초의 SSCP 방법은 genomic DNA를 적당한 제한효소로 절단하고 alkali로 denaturation시킨 후 non-denaturing polyacrylamide gel에서 전기영동한 다음 이를 nylon membrane에 transfer하여 fragment DNA를 옮겨 놓은 후 방사성 동위원소로 표지된(radiolabeled) RNA 혹은 DNA probe를 이용하여 autoradiography를 실시함으로써 X-ray film에 나타나는 정상 유전자와 변이된 유전자와의 전개거리의 차이를 확인하여 돌연변이를 검색하였다. 그러나 그 후 PCR 산물을 SSCP로 분석하는 방법이 소개되었고, 이 방법이 대중화됨에 따라 요즘은 PCR-SSCP라는 용어로 많이 불리어지고 있다. 최근까지는 PCR-SSCP를 할 경우 PCR 산물에 직접 동위원소를 표지하여 autoradiography를 통해 결과를 얻는 방법이 많이 이용되었으나 최근에는 silver staining으로 polyacrylamide gel을 검색하는 방법이 소개되어 현재 이 방법이 유용하게 이용되고 있다. Silver staining 방법은 방사성 동위원소를 사용하지 않고도 훨씬 더 빠른 시간에 PCR 산물을 분석할 수 있는 장점이 있으며 민감도(sensitivity)에는 방사성 동위원소를 이용한 방법과 별 차이가 없으므로 더욱 편리하고 안전하게 실험을 진행할 수가 있게 되었다.

 

3) RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)

 

cDNA를 cloning하기 위해서는 cDNA library를 screening하는 방법이 현재 가장 일반적이라 할 수있지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전한 cDNA를 얻어낼 수 있다. 그러나 이런 과정은 대단히 시간과 노력이 소모되는 작업이며 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우는 더더욱 힘든 일이 될 것이다. 또한 initiation codon부터 termination codon까지 open reading frame(ORF)을 완전히 결정한 경우에도 cDNA의 5'과 3'-끝의 non-coding region 일부는 library screening에서 얻기가 어렵다. 이러한 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 다음과 같은 방법을 소개하고, 이를 RACE(rapid amplification of cDNA ends)라 이름하였다. 즉, cDNA의 일부 염기서열을 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR reaction을 통해 5' 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE에서는 mRNA의 3'-end에 존재하는 poly(A) tail을 이용할 수 있으므로, down stream primer로 oligo-(dT) primer를 쓴다. 그러나, 5'-RACE의 경우는 gene specific primer로 합성한 1st single strand cDNA의 끝에 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 poly(A) 혹은 poly(C) tail을 인위적으로 만들어 주어야만 한다.

 

4) ISPCR(In Situ Polymerase Chain Reaction)

 

PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 sensitivity와 ISH의 specificity를 고루 갖추고 있다. ISPCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, slide glass 등의 사용에 적합한 ISPCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.

 

ISPCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR이 끝난 후에 세포 안에서 증폭된 PCR 산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로 적당한 세제의 적절한 선택과 사용이 무엇보다 중요하며 PCR 산물이 세포 밖으로 유출되는 것을 막기 위해서는 single primer pair with complementary tail, biotinylated dNTPs, multiple overlapping primer pair 등을 이용한 방법이 소개되어 있다.

 

현재까지 ISPCR 방법의 효율은 그다지 높지 못한 것으로 알려져 있으며 specificity를 증가시키기 위해서는 DNA probe를 이용한 in situ hybridization을 시행하거나 Southern blot hybridization을 시행하는 것이 좋은 방법이 된다. 효율이 별로 높지 못한 방법임에도 불구하고 ISPCR에 대한 관심이 최근 크게 증가하고 있는 것은 여러 가지 질병들의 조기 발견에 큰 도움을 받을 수 있을 것으로 기대되기 때문이며, 지금도 여러 회사에서 ISPCR에 유용한 기구들을 제작, 판매하고 있으나 더 좋은 기구의 개발이 이루어져 효율을 더욱 높일 수 있다면 ISPCR이 더욱 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

 

5) DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcriptase PCR)

 

 

일반적으로 고등동물에서는 약 100,000가지 정도의 서로 다른 유전자가 발현되고 있으며 각각의 세포 한 개에서는 이중 약 15%만이 발현되고 있다. 발생, 분화, homeostasis, 세포주기 조절, 노화, 발암과정 및 세포의 퇴화 등의 과정에서 표현되어 나타나는 유전자들은 전체 유전자들 중에서 일부가 선택되어 나타나는 것이라고 할 수가 있다. 특정 세포에서 발현되는 특정 유전자들을 찾아내기 위하여 주로 사용되는 방법은 subtractive hybridization 또는 differential hybridization 방법이었으나 최근 PCR을 이용하여 유전자를 찾아내는 방법(DDRT-PCR)이 개발되었다.

 

DDRT-PCR이란 서로 다른 세포로부터 RNA를 분리한 후 특정하게 발현되는 mRNA를 찾아내기 위하여 T 염기 10개와 비특정염기 2개가 연결된 oligonucleotide를 primer로 이용하여 cDNA를 합성한 후 이 primer와 비특정 염기서열을 지닌 oligonucleotide를 primer로 이용하여 PCR 하였을 때 나타나는 여러가지 PCR 산물을 비교함으로써 서로 다른 세포로부터 증폭된 PCR 산물에 차이가 있는지 없는지를 확인하는 방법이다. 서로 다르게 증폭된 PCR 산물을 선택하여 이와 같이 증폭된 DNA가 특정 세포에서 특징적으로 발현되는 유전자인지를 보는 것으로 subtractive hybridization보다 방법이 훨씬 간단한 것이 장점이지만, 실험의 sensitivity와 specificity가 낮은 것이 단점이다. 최근 이 방법에 대한 연구가 많이 진행되면서 새로운 더 좋은 방법들이 계속 발표되고 있으므로 최신 논문을 참고로 적절한 조건을 찾아내어 실험을 시행하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

 

6) Hot start PCR

 

Taq1 polymerase는 37℃에서도 그 활성이 좋기 때문에 간혹 가다가 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 primer가 DNA molecule에 붙어서 extension이 일어나는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 annealing이 일어날 경우 primer가 mismatch할 확률이 높고, 따라서 결과적으로 정확도가 떨어지는 band를 얻게 된다. 이것을 막는 방법이 Hot-start PCR를 이용하는 것이다. Hotstart PCR에서는 primer가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에 PCR이 일어나도록 필요한 물질(ex. polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어준다. (물론 그 전에는 안 넣어준다는 말이다.) 이렇게 하면 위에서 말한 것과 같은 mismatch를 피할 수 있어, 상대적으로 clear한 band를 얻을 수 있다.

 

7) RAPD PCR

 

RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 일반적으로 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다. PCR할 때 primer가 짧을 경우 genome 상에 여러 군데 달라 붙어서 여러 fragment를 만든다. 이렇게 해서 생겨난 여러 fragment를 전기영동을 사용해서 확인하면 생명체마다 각각 독특한 band를 형성하는데 이것을 가지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 생명체가 비슷한 종일 경우에는 band의 모양이 비슷할 것이며, 그렇지 않을 경우에는 서로 많은 차이를 나타낼 것이다. 이 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉬워 genome sequencing을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 나타내기 위해서 많이 사용된다.

 

8) Touchdown PCR

 

이 방법은 PCR할 때 Tm(melting temperature)을 알기 위해서 하는 PCR 방법이다. PCR 과정에서 매 2 cycle 마다 annealing temperature을 1℃씩 낮춘다. 일반적으로 annealing이 Tm에서 1℃만큼 차이가 난 온도에서 일어날 때 한 cycle에 product의 양이 두배 정도 차이가 난다. Touchdown PCR에서는 2 cycle 마다 온도를 낮췄으므로 1℃에 product의 양이 4배가 차이나는 셈이다. 이것을 이용해서 Tm을 알 수 있다. (즉 온도가 1도 내려갔을 때 product의 양이 4배 증가한 과정에서의 temperature가 Tm이 된다.)

 

9) Long Accurate PCR

 

일반적으로 PCR로는 많아야 3kb, 좀 더 이상적일려면 1kb 미만의 크기의 DNA를 증폭할 수 있으나 이 방법을 사용하면 5-40kb의 DNA도 증폭할 수 있다. 이 long accurate PCR에서는 polymerase를 두 개 사용하는데, 그중 하나가 minor-proofreading을 할 수 있어서, 긴 DNA를 증폭할 때 error rate를 감소시켜 준다.

 

10) Asymmetric PCR

 

Single strand를 얻을 목적으로 이용하는 PCR방법이다. Primer를 두 개 사용하는데 두 primer를 농도가 100:1로 섞어 사용한다. PCR의 초기에 한쪽의 primer는 소비되어 버리고 과잉의 primer에서 single strand DNA가 생성된다

 

 

11) Nest PCR

한번 PCR로 증폭한 DNA 단편을 한번 더 내부의 primer를 사용하여 증폭하는 방법이다. 이는 비 특이적 반응을 감소 시키며, PCR을 2회 실시하므로 감도가 상승하는 효과를 얻을 수 있다.

 

12) Inverse PCR

 

Inverse PCR은 기존에 서열을 알고 있는 DNA의 양 옆에 서열을 알지 못하는 region이 있고, 이것을 알고자 할 때 많이 이용된다. 예를 들어

 

******=========****** (** 서열을 알지 못함, == 서열을 알고 있음)

 

이런 염기 서열에서 ** 부분을 알고자 할 때 이용한다. 제일 먼저 제한 효소로 자르고, 자른 부위를 원으로 만든다. (자른 부위가 sticky end이므로 가능하다.) 그리고 그 원으로 된 곳에다가 primer를 붙이는데, 이 때 elongation이 같은 방향으로 가도록 primer를 붙인다. Inverse라는 말은 primer가 기존의 PCR과는 다른 방향으로 간다고 해서 붙여졌다.