Northern Blot

Northern Blot

 

  1975년 Southern EM이 제한효소를 절단해서 agarose gel 전기 영동으로 분획한 DNA 단편을 직접 Nitro-cellulose filter에 옮기는 방법을 개발했다. 이 Southern blot는 유전자 해석 수단으로서 아주 유용하기 때문에 그 후 널리 이용되고 있다. 1977년 Stark는 agarose gel 전기 영동으로 분획한 RNA를 filter에 옮기는 방법을 개발했다. 이 방법은 DNA에 대한Southern blot 와 대비시켜 Northern blot로 부르게 되었다.

 

1. 목적

 RNA의 정성, 정량을 행하기 위하여 이용된다. 이 방법에 의해 RNA의 크기나 발현 량의 정보가 얻어져 mRNA의 발현이 어느정도 행하여져 있는가를 알 수 있다.

 

2. 원리

 

 기본적으로는 Southern blotting 과 동일하다. RNA를 전기 영동한 후 filter상에 고정하여 DNA(또는 RNA)를 probe로 하여 hybridization 해서 목적의 RNA를 검출한다.
 그러나 RNA는 이차구조를 만들기 쉽기 때문에 gel 중에서 변성된 상태로 전기 영동을 시행한다.

 

3. 방법

  

(1) 취급에 따른 일반적 주의 RNA에서 바른 정보를 얻기 위해서는 RNA를 가능한 한 분해되지 않은 상태로 조제하지 않으면 안된다. 특히 RNase에 의한 분해에 주의할 필요가 있다. RNase의 오염으로부터 시료를 지키기 위하여 고무장갑, disposable 제품, Autoclave, 건열 멸균, RNase 저해제 등을 이용한다. 유리기구, teflon제 기구는 세정후 증류수로 잘 헹구어서 건열한다. 전기 영동조 등 건열할 수 없는 기구는 세정 후 5%의 과산화수소수에 1시간 담그고 증류수로 잘 헹군다. 물은 Milli Q water를 Autoclave하여 사용한다. 시약은 autoclave 하든가 할 수 없는 것은 여과 멸균한다. 또 RNA는 DNA 와 달리 alkali에서 가수 분해되기 쉽다. 완충액 등의 pH가 alkali로 되지 않도록 주의 할 필요가 있다.

 

(2 ) 추출조제 total RNA 나 poly(A)+RNA를 이용한다. RNA를 조제한 경우, 그 중 80% 정도가 rRNA이며 mRNA 중의 정보를 얻기 위해서는 가능한 한 rRNA의 혼입을 방지하는 것이 좋다. 목적의 mRNA가 적다고 생각되는 경우는 RNA를 Oligo(dT) column 처리를 한다. mRNA는 poly(A) 구조를 3`말단에 가지고 있기 때문에 이 조작으로 mRNA를 수 십배로 농축 정제가 가능하다. 그 외 단백질 혼입도 가능한 한피하지 않으면 안된다.

 

1. agarose gel의 제작(1% agarose, 1 x MOPS, 2.2mol/l formaldehyde)

 

2. RNA sample의 조제(RNA〈 30 g, 1 x MOPS, 2.2mol/l formaldehyde, 50% formamide) -  (55 - 65℃, 15분간)

 

3. 전기영동(UV 조사)  - 100 - 120V, 2 - 3시간(2 - 3분간)

 

4. gel을 꺼내고 10 x SSC에 담근다 - 20분 - 1시간

 

5. transfer  - 하룻밤 overnight

 

6. 건열 처리 - 80℃, 30분 - 2시간

 

7. prehybridization - 42℃, 2 - 3시간

 

8. hybridization  - 42℃, 하룻밤 overnight

 

9. 세 정  - 1 x SSC, 0.1% SDS, 실온, 20분간 1회
                  0.2 x SSC, 0.1% SDS, 68℃, 20분간 3회

 

10. autoradiography