Oxidative Stress Detection

Oxidative Stress Detection

 

Hydrogen peroxide, superoxide 그리고 hydroxyl radical 같은 Reactive oxygen species (ROS)는 모든 호기성 생물들의 산소 대사산물입니다.  ROS 가 생성 되는 것은  미토콘드리아 전자전달계의 에너지 생성 과정의 결과로써, 바이러스나 박테리아 같은 미생물에 대항하기 위한 방편으로서, 그리고   cytochrome p450 system  관련된 대사 과정 등에서 발생되며 UV,  ionizing radiation, redox chemicals 그리고 담배 연기 등의 환경적 요인에 의해서도 쉽게 ROS 가 생성됩니다.       

대부분의 항산화 기전은 superoxide dismutase, catalase , glutathione peroxidase 등의 항산화 효소와 vitamins A, E,ascorbate, glutathione, thioredoxin 등 저 분자량의 항산화 물질 들로 구분되어집니다.  대부분의 활성 산소들은 이들 항산화 물질들의 작용에 의해 중화되지만  이런 방어 시스템을 능가할 만큼의 지나친 스트레스는 lipids, proteins , DNA와 같은 생체 분자들에 손상을 입히게 됩니다.

바이오맥스에서는 이와 관련하여 stress marker, antioxidant activity, metabolite 등을 측정함으로써 oxidative stress  연구에 기초적인 자료를 제공받을 수 있도록 하여줍니다.

 

◆ DNA Damage Detection

Superoxide 와 Hydrogen peroxide로부터 Fenton reaction에 의해 발생되는 hydroxy radical 은 DNA에 작용하여 DNA의 다양한 구조적 변화를 초래합니다. 대표적인 것이  hydroxy radical 이 deoxyribose 부분을 공격하여 base를 유리시키는 것인데 이로 인해 당의 구조가 변화하고 AP site 가 형성되면서  DNA의 결합이 끊어지게 됩니다. 보통 하루에 하나의 세포에서 대략  2x10^5 개의 base lesions 현상이 ROS에 의해서 생기는 것으로 추정됩니다.  

DNA Damage Quantification Kit  는 96 well microplate를 이용한 colorimetric assay 법으로 genomic DNA의  abasic sites를 정량할 수 있습니다.

8-Nitroguanosine이라는   nitrated base를 가지는 독특한 구조의 RNA는 주로 염증에 의해 대량으로 발생되는 nitric oxide와 superoxide anion radical의 반응에 의한 peroxynitrite로 인해 생깁니다.  이와 같이 화학적으로 변형된 nucleotides는 DNA복제 중 돌연변이의 원인이 되므로 8-nitroguanosine은 돌연변이와 종양에 관련된  DNA damage의  marker 역할을 합니다.

참고: Using a polyclonal antibody, Dr. Akaike, et al. discovered that inflamed lung epitherial cells of an influenza-infected mouse generated a large amount of nitroguanosine and the localization of nitroguanosine corresponded to the location of iNOS antibody staining site. With the use of a high affinity monoclonal antibody, it was found that nitroguanosine is present in normal cells although its level was very low. Therefore, it is suggested that nitroguanosine is not only a DNA damage marker but also plays a role in controlling cell functions by mediating redox reactions.

Anti-Nitroguanosine antibodies:
Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody (Clone#NO2G52)
Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody

8-Nitroguanine:
8-Nitroguanine (lyophilized)

 

◆ SOD Activity Assay

Superoxide dismutase (SOD)는 가장 중요한 항산화 효소의 하나로  superoxide anion (O2·-)을 hydrogen peroxide와 산소분자로 변화시킵니다.

SOD의 활성을 측정하기 위한 것으로 몇 가지 직접/간접적인 측정 방법이 고안되었는데, 그중에서도 nitrotetrazolium blue를 이용한 간접적인 측정법이 그 편리성 때문에 많이 이용되고 있습니다.  하지만 이 방법에는 몇가지 단점이 있는데 formazan dye의 water solubility 가 낮고    xanthine oxidase의 환원형과도 반응한다는 것입니다.  cytochrome C 역시 SOD활성 측정에 많이 이용되고 있으나 적은 양의 SOD활성을 측정하기에는  cytochrome C와 superoxide의 반응성이 너무 높다는 단점이 있습니다.  

SOD Assay Kit-WST는 기존에 많이 이용된 왔던 xanthine oxidase의 inhibition을 통한 활성 측정법을 이용하면서도  Dojindo사의 독특한 highly water-soluble tetrazolium salt, WST-1 (2-(4-iodophenyl)- 3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt)를 사용하여 편리성과 감도를 한층 높인 제품입니다. WST-1은 superoxide anion과 반응하여 수용성의  formazan dye를 생성합니다. 한편  WST-1는  xanthine oxidase의 환원형과도 반응하지 않을 뿐 아니라 cytochrome C와 비교했을 때 superoxide anion과의 반응성이 70배나 낮아서  SOD의 농도가 낮은 샘플에서도 높은 감도를 보입니다.

 

◆ Glutathione Assay

Total Glutathione Quantification Kit

Glutathione (GSH) 은 동식물 조직이나 세균, 효모 등에서 볼 수 있는 가장 대표적인 Thiol 화합물입니다.  GSH는 항산화 작용이나 단백질의 thiol group유지, 아미노산의 수송 등의 다양한 기능을 가지고 있습니다.  이러한 작용의 결과로 GSH 은 산화된 형태의 glutathione disulfide (GSSG)로 변하지만 이는 다시  glutathione reductase에 의해 즉시 환원되므로 대부분의 생명체에서 GSH가 더 일반적인 형태입니다.

DTNB (5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)) 는  Ellman's Reagent로 알려져 있고 thio화합물을 검출하기 위해 고안된 시약입니다, 1985년  Dr. M. E. Anderson 은 glutathione을 측정하기 위해 DTNB and glutathione reductas를  사용한 glutathione recycling system을  고안하였습니다.  DTNB와  GSH 의 반응으로 노란색의 2-nitro-5-thiobenzoic acid 와 GSSG 이 생성 되는데  412nm에서 OD값을 측정함으로써  GSH 농도를 계산할 수 있습니다. GSSG 은  glutathione reductase 에 의해  GSH로 환원되어 , 다시 DTNB 와 반응하여 2-nitro-5-thiobenzoic acid를 생성하는 recycling reaction을 이루게 됩니다.

Colorimetric Reduced Glutathione Assay Kit:

환원형의 GSH를 측정하기 위한 많은 방법이 고안되어 왔지만 정확하게 측정하기란 매우 힘들고 어렵습니다.

이 제품은   colorimetric method를 이용, 손쉽게  glutathione을 측정할 수 있도록 하며 샘플에 존재하는 모든 mercaptans (RSH)과 4-chloro-1-methyl-7-trifluromethyl-quinolinium methylsulfate로부터 thioethers의 생성을 원리로 하고 있습니다.

Glutathione Peroxidase Human Plasma ELISA Kit: Glutathione peroxidase는 glutathioneare 존재하에  hydroperoxides를 환원시키는   selenoenzyme으로  혈구세포에서 인체의 경우  plasma-specific glutathione peroxidase (pl-GPx)를 발현시키기도 합니다. 이 제품은 polyclonal anti-human pl-GPx로 코팅된 plate을 이용한   sandwich ELISA kit입니다. 샘플을 반응시키고 난 후 결합된  pl-GPx는 pl-GPx에 특이적으로 결합하는 biotinylated-polyclonal antibody와 streptavidin coupled to alkaline phosphatase에 의해 405nm 흡광도 측정에 의해 검출됩니다.

 

◆ Isoprostane Assay - Molecular Biomarkers for Oxidative Stress

이전에 8-epi-PGF2 a로 불렸던 15-F2t-Isoprostane 은 Oxidant status의 gold standard로 널리 인식되고 있습니다. 실제로 Isoprostane이 Oxidative stress의 가장 강력한 Biomarker라는 증거들이 많이 제시되고 있습니다.

참고:  Professors L. Jackson Roberts and Jason Morrow at Vanderbilt University originally isoprostanes as biomarkers for oxidative stress in vivo. Read Roberts' & Morrow's review of isoprostanes & oxidative stress

Isoprostane immunoassay kit   Oxford Biomedical Research는  오랫동안  isoprostane assay를 위한   ELISA KIT 개발에 노력해 왔고 또 Oxidative stress의 측정을 위해 Isoprostane을 이용하는 데 있어 Licence를  가지고 있습니다.  Oxford Biomedical Research에서는 이와 관련하여 두 가지 형태의 ELISA Kit를 공급하며 세계의 많은 Researcher와 supplier들이 이 제품을 이용하고 있습니다.

 

◆ Total Antioxidant Power  Colorimetric Microplate Assay Kit

 생물체는 몇 가지 항산화 기전을 보유하고 있으며 지용성(e.g. vitamin E) 또는 수용성(uric acid, vitamin C, bilirubin, thiols  and  gluthathione)의  물질들이 이와 관련하여 중요한 역할을 합니다. 항산화 기전은 생체내에서 매우 복잡하게 나타나고 개체의 영양상태나 생활양식, 환경에 따라 항산화 능력은 매우 다르게 나타납니다.  

이 새로운 제품은 vitamins, proteins, glutathione 등의 항산화 작용에 의해 결정되는  total antioxidant activity를 정확하게 측정할 수 있도록 하여줍니다. 샘플 내의 항산화제들의 복합적 작용에 의한  Cu2+ 의 환원 양상을 bathocuproine (BC)을 통해 측정함으로써 antioxidant level을 알 수 있습니다. 환원된 Cu+ 와  bathocuproine (BC) 복합체는  매우 안정적이며 480-490nm에서 최대 흡광도를 보입니다.

 

◆ Other Oxidative Stress Related Components

Linoleic Acid Peroxidation (HODE) ELISA Kits Linoleic acid is the predominant polyunsaturated fatty acid (PUFA) in the human diet. The hydroxyoctadecadienoic acid (HODE) derivatives of linoleic acid, 9(S)-HODE, 9(R) HODE, and 13(S)-HODE, are the most widely distributed of the known linoleic acid metabolites. HODEs can be generated enzymatically by cyclooxygenase, lipoxygenase, and some cytochrome P450s. However, the bulk of linoleic acid peroxidation, especially generation of 9-HODEs, occurs by non-enzymatic processes so that HODEs are excellent indicators of free radical mediated lipid peroxidation. In mammalian cells, free radicals are derived primarily from peroxide and singlet oxygen, which are referred to as reactive oxygen species (ROS). ROS-derived free radicals include the super-oxide anion and the hydroxyl radical. Most ROS diffuse only a nanometer or so before reacting. Among the most important targets of free radical reactions in vivo are lipids, and resultant oxidized lipids can travel throughout the circulatory system.        

9(±)-HODE EIA Kit: This competitive ELISA kit permits the quantitative analysis of total 9-HODE (9(S) and 9(R)-HODEs) in biological fluids.

13(S)-HODE EIA Kit: The major monohydroxy metabolite of linoleic acid in vascular endothelium is 13-HODE, which plays an key role in interactions between endothelial cells and other cells such as platelets and tumor cells.

Anti-Malondialdehyde-Deoxyguanosine Adduct (Anti-Malondialdehyde-Deoxyguanosine Adduct)

Glutathione Peroxidase Human Plasma ELISA Kit: This is a sandwich ELISA kit for a plasma-specific glutathione peroxidase.

Myeloperoxidase Assay Kit (Human): This is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

Lactoferrin Human Plasma Kit: Human lactoferrin in blood is secreted from neutrophiles, and its concentration is related to the total neutrophil pool and the rate of turnover. This is a sandwich enzyme-linked immunoassay kit.

Colorimetric Cytotoxicity Assay Kit: This colorimetric assay kit can be used to monitor the release of a cytosolic enzyme from cultured cells that suffer damage or death as the result of in vitro exposure to toxins. The amount of LDH released is proportional to the number of d`maged/lysed cells.

75 kDa Glucose Related Protein: This 75 kDa glucose regulated protein (Grp75) is a mitochondrial matrix protein that is generally recognized as a member of the heat shock protein 70 (hsp 70) class of proteins. Grp 75 is induced under conditions of low glucose and other nutritional and environmental stresses.

 

출처 : http://www.biomaxkorea.com/hot/ros.htm