Amino Acid 분자들이 전기적으로 중성이 중성인 지점을등전점 (Isoelectric Point)이라 하며 등전점은 Amino Acid 의 종류에 따라 틀려지게 된다.
pH가 등전점보다 높은 수치에 이르게 되면 NH2-CHR-COO- 상태의 Alanine이 생성되게 되며 이때 두번째의 buffering pH Region에 도달하게 된다. pH = 9.69 지점은 +NH3-CHR-COO- 와 NH2-CHR-COO- 의 농도가 동일한 지점, 즉 +NH3 의 pK' 지점이다. pH가 12 이상에 이르게 되면 모든 Alanine은 Deprotonation 되어 NH2-CHR-COO- 의 상태가 되며 Titration은 종결되게 된다. 이러한 Amino Acid Titration에서 우리가 얻을 수 있는 정보를 요약하면 다음과 같다.
① Amino Acid에 존재하는 2개의 ionizable Group, 즉 Amino 기와 Carboxyl 기의 pK'를 알수 있다. 위의 Alanine Titration에서는 Carboxyl기의 pK'는 2.34 이며 Amino 기의 pK'는 9.69라는 것을 쉽게 알수 있다. Acetic Acid의 Carboxyl 기의 pK'인 4.67 보다 Alanine의 pK'가 현저하게 낮은 까닭은 α-Carbon에 붙어 있는 +NH3 의 Positive Charge가 COOH의 proton과 Repulsion이 작용하기 때문으로 보인다. 따라서 평형이 COOH -> COO- 의 방향으로 촉진되어 pK'가 낮아지게 된다.
② Titration 의 대상이 되는 Amino Acid의 고유한 특성인 isoelectric Point를 알수 있다. 따라서 특정한 pH에서의 Net Charge를 구할 수 있다.
③ Amino Acid의 Buffering Power가 존재하는 pH 영역을 알수 있다. 즉 Alanine의 경우 2.34 부근과 9.69 부근에서 Buffering Power를 지니고 있음을 알수 있다.
라. 여러가지 Amino Acid의 산-염기 성질 각각의 Amino Acid 는 서로 다른 산-염기 성질, 즉 Carboxyl Group의 pK', Amino Group의 pK', Isoelectric Point, Buffering Power Region 을 지닌다. 모든 Amino Acid는 공통적으로 동일한 α- Carboxyl Group과 α- Amino Group을 가지고 있지만 이러한 차이를 보이는 것은 근본적으로 각 Amino Acid의 성질을 결정하는 Side Chain의 산염기적 성질 때문이며 Side Chain이 Carboxyl Group의 pK', Amino Group의 pK', Isoelectric Point 등을 변화시킨다는 것을 표 1 을 통해 확인할 수 있다. 표 1 : 여러가지 Amino Acid의 pK값
이온화될 수 있는 Side Chain을 지니는 Amino Acid는 Alanine의 경우에 비해 복잡한 Titration Curve를 가진다. 즉 α-NH3+ 과 α-COOH 에 추가되어 Side Chain의 pK'가 추가됨으로써 3번의 Titration Stage를 가짐으로써 보다 Titration Curve가 복잡해짐은 물론, Side Chain의 이온화가능한 작용기가 α-NH3+ 과 α-COOH 의 pK' 에 변화를 가져오게 된다. 즉 두개의 Titration Curve를 통해 각 Amino Acid의 pK1'과 pK2‘가 서로 상이함은 물론 Isoelectric Point 또한 다르다는 것을 쉽게 알수 있다. 마. Amino Acid Titration의 의의 Ion-Exchange Chromatography나 Electrophoresis는 각각의 Amino Acid 의 산 - 염기 성질의 차이 (Isoelectric Point 등) 를 이용하여 Amino Acid를 분리/정량하는 방법이다. 이러한 방법의 이해를 위해서는 먼저 Amino Acid의 산 - 염기적 성질들을 알아야 하며 Amino Acid Titration 을 통해 각각의 Amino Acid 들의 고유한 산 - 염기적 성질 (pK',Isoelectric Point 등) 을 알수 있다. Protein 정량분석 (뷰렛법/로우리법) 가. Protein 정량의 개요 Protein을 Hydrolysis시키면 Peptide bond가 끊어지면서 Amino Acid가 유리된다. 보통 Peptide나 단백질을 6N HCl 용액이 들어있는 시험관에서 공기를 제거하고 밀봉한 후 100 °C 에서 8 - 24 시간 동안 가열하여 가수분해시킨다. 이러한 가열조건에서는 모든 Peptide Bond가 파괴되고 Glutamine과 Asparazine의 경우에는 Side Chain의 Amide bond도 파괴되게 된다. 또한 Trp.과 Ser. Thr 등의 Amino Acid는 파괴되기 때문에 이러한 Protein을 정량하기 위해서는 특별히 주의를 기울여야 한다. 산성 용액에서 파괴되는 Amino Acid를 분석하기 위해서는 별도로 Protein 을 Alkaline Hydrolysis 시킨 후 분석한 후에 보정해야 한다.
